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1.熒光基礎知識

在顯微成像中，熒光指的是一種光致發(fā)光現(xiàn)象，某些分子能吸收特定波長的光線，然后再發(fā)射出其他波長的光線的物理現(xiàn)象，這種分子一般稱為熒光團。通常情況下，由于斯托克斯位移，熒光團的最大激發(fā)和發(fā)射光譜之間存在差值，發(fā)射光線能量低于吸收光線，波長比激發(fā)光更長。
熒光現(xiàn)象有兩種：自發(fā)熒光與繼發(fā)熒光。自發(fā)熒光也稱固有熒光，是指經照射后就能發(fā)出熒光；繼發(fā)熒光也稱二次熒光，物質經照射后不能或只能部分發(fā)生微弱熒光，需先用熒光染料標記處理，再經照射才能發(fā)生熒光。目前在熒光顯微技術中，主要利用的是繼發(fā)熒光現(xiàn)象。

念珠藻葉綠體的自發(fā)熒光，明美MF52-N拍攝

熒光產生包含激發(fā)和發(fā)射兩個過程，在熒光顯微技術中具體體現(xiàn)為以下幾個關鍵部件：（1）激發(fā)光源：主要包含以下兩個指標

• 光源光譜覆蓋發(fā)射光譜：熒光團在特定波段范圍才能被好的激發(fā)，因此激發(fā)光源的光譜范圍要能匹配所觀察樣本中的熒光團激發(fā)特征。
  

• 發(fā)射光譜波段的強度：熒光信號一般較弱，需要使用較高亮度的激發(fā)光以產生較強信號的發(fā)射熒光信號。

明美-四通道LED光源MG120，寬光譜 + 高光功

（2）激發(fā)塊：用于形成特異性激發(fā)/發(fā)射的一組濾光片，一般包含以下三個

• 激發(fā)濾光片EX：濾過光源中特定波段的光，用以激發(fā)樣本中特定染料

• 發(fā)射濾光片EM：允許熒光團發(fā)射的特定波段的光通過

•  二向分色鏡DM：反射激發(fā)波段的光，透過發(fā)射波段的光。透射熒光顯微鏡沒有這個濾光片，但目前主流都是落射熒光顯微鏡，會有二向分光鏡。

明美可定制適配四大各品牌，不同波段需求的激發(fā)塊

2.熒光顯微成像的應用

熒光顯微鏡利用自發(fā)熒光或繼發(fā)熒光現(xiàn)象，廣泛用于生物（醫(yī)學）、礦物、材料科學等領域的顯微熒光觀測。①在生物學領域，主要借助熒光染料標記，可準確和詳細地識別細胞和亞微觀細胞成分。②在礦物學領域，通常用于研究有自發(fā)熒光特性的物質，如石油、煤炭、氧化石墨烯等礦物。③在材料科學，可用于紡織工業(yè)或造紙業(yè)來分析基于纖維的材料，包括紡織品和紙張，在半導體領域，也可用來觀測具有熒光特性的材料如磁珠等。

明美MF31-LED熒光顯微鏡觀察SBS改性瀝青

MF43-N拍攝的磁珠熒光圖片

熒光顯微技術在生物學領域中應用是非常廣泛也是最復雜的，主要是對細菌、細胞、組織或小型生物（如斑馬魚等模式生物）進行標記成像，它的微觀層面都是通過熒光染料對分子層面進行標記。從熒光染料的選擇看，通常需要考慮幾個因素，一是熒光染料標記的位置，二是該染料對應的激發(fā)特征，包括吸收光譜特征和發(fā)射光譜特征。借助熒光染料，熒光顯微技術不只局限于蛋白質，它還可以對核酸、聚糖進行染色，甚至鈣離子等非生物物質也可以檢測。以下根據染料結合的位置列舉了一些常見的熒光染料及應用范圍：

FITC熒光染色，MF52-N拍攝

（1）免疫熒光（IF）：主要標記的是蛋白質。免疫熒光技術利用抗體可以和相應抗原特異性結合的特性，主要有兩種方式：一是利用內源熒光信號，即通過克隆技術用遺傳學方法將熒光蛋白與目的蛋白相連，如GFP等；二是利用熒光標記的抗體與目的蛋白特異性結合。

• FITC（異硫氰酸熒光素）：是一種有機熒光染料，495/517 nm為該染料激發(fā)/發(fā)射峰值，可以和蛋白質上的基團結合，主要用于免疫熒光和流式細胞術中。

• TRITC（四甲基羅丹明-5(6)-異硫氰酸）：屬于羅丹明家族的衍生物，550/573 nm為該染料激發(fā)/發(fā)射峰值，可與蛋白質結合。

• 花箐染料（cy3、cy3.5、cy5、cy5.5、cy7等系列）：非特異性吸附少，消光系數(shù)高，熒光量子產率高，從而讓標記顯影時背景弱，信號強。除細胞顯影外，它們也常用于生物篩選、蛋白免疫印跡、生物醫(yī)學顯影、小動物體內成像等。

• Alexa Fluor系列：屬于帶負電荷且親水的熒光染料系列，是不同基礎熒光物質的磺化形式。這些產品標識涵蓋了對應的激發(fā)波長，相比于FITC等染料，具有更好的穩(wěn)定性和熒光亮度。

DAPI熒光染色，MF52-N拍攝

（2）DNA染色：主要標記核酸。同蛋白質一樣，對核酸進行標記與研究同樣有重要意義，如對細胞核（主要成分為核酸）進行染色標記可以判斷細胞的數(shù)量和位置。

• DAPI（4',6-二脒基-2-苯基吲哚）：當DAPI與雙股DNA結合時，在358nm處有一個最大吸收峰，在461nm處有一個最大發(fā)射峰，其發(fā)射光的波長范圍含蓋了藍色至青綠色。DAPI也可與RNA結合，但產生的熒光強度不及與DNA結合的結果。DAPI可以透過完整的細胞膜，因此被廣泛用于活細胞和固定細胞的染色。

• Hoechst（33258、33342、34580）：這三種染料都可在350nm左右的紫外光激發(fā)，在461nm處發(fā)出藍靛色熒光。與DAPI類似，Hoechst可透過完整細胞膜，被廣泛用于活細胞和固定細胞染色。

• PI（碘化丙啶）：是一種不能透過細胞膜的DNA染色劑。與核酸結合后，最大激發(fā)波長為538 nm，最大發(fā)射波長為617 nm。由于該染色劑無法進入完整的細胞中，因此該染色劑常用于區(qū)分細胞群中的活細胞和死細胞。

Fura2鈣離子探針做的研究圖片， 引自公開文獻

Front. Neural Circuits 11:11. doi: 10.3389/fncir.2017.00011（3）離子成像：研究細胞中各種離子的流動與分布對細胞活動的深入理解有重要作用。通過各種離子指示劑，如鈣離子、鈉離子、鎂離子、鋅離子等指示劑與離子結合形成熒光團，利用光譜特征檢測對應離子的分布狀態(tài)。

3.熒光顯微成像的挑戰(zhàn)

應用熒光顯微技術進行成像的過程中，不僅要考慮成像的質量，包括分辨率、對比度、熒光信號強弱、背景光、多通道成像等，還要考慮熒光染料、光照等對樣本的影響，比如熒光染料毒性、光毒性、光漂白等。以下列出了熒光顯微技術應用中的常見挑戰(zhàn)與應對方法：

汞燈需搭配帶計時器的復雜控制箱來使用

（1）激發(fā)光源選擇和使用。傳統(tǒng)熒光成像使用的是高壓汞燈，具有特異性的光譜特征和較高的光強，但使用有很多麻煩，首先需要預熱，然后光強靠ND濾鏡調節(jié)，最后壽命較短可能就200小時，在壽命用完前還會有光強衰減問題，需要調整ND濾鏡，替換燈泡后需要重新校中。目前很多應用都用LED熒光光源取代汞燈作為熒光光源，如寬光譜大功率LED熒光光源MG-100，壽命長單個可以頂50個汞燈，光強更穩(wěn)定可控，并且可以即開即用，省事省心。

明美可定制適配四大各品牌的濾光片組

（2）濾光片質量和匹配度。激發(fā)塊中的濾光片質量會影響激發(fā)光和發(fā)射光的透過率，影響熒光效率并帶來雜散光和背景噪聲問題。同時，濾光片的參數(shù)能否匹配染料的激發(fā)峰和發(fā)射峰，也會對熒光效果產生重大影響。對于簡易熒光需求，明美建議使用數(shù)顯熒光模塊，整合光源和BGU等常用激發(fā)塊，可以為四大各品牌顯微鏡升級熒光觀察，簡單易用效果好。對于專業(yè)熒光需求，明美提供匹配四大各品牌主流熒光顯微鏡的激發(fā)盒和濾光片組，可按需定制不同濾光片組合，如鈣離子Fura2探針需要用U激發(fā)G發(fā)射，一般的U激發(fā)B發(fā)射濾光片組并不適合。

MF43-N+MC50-S拍攝的小鼠腦片熒光圖像

（3）光毒性與熒光染料毒性：在生物學領域的熒光成像中，需考慮光毒性與熒光染料毒性對樣本的影響，如細胞內的有機分子在與氧反應時吸收光發(fā)生分解并產生自由基，部分熒光染料本身也能產生自由基，這是引起細胞等生物樣本損傷的主要來源。通常的應對思路是：①使用具有較低能量（波長較長）激發(fā)光譜的熒光染料；②盡可能低的光強和盡可能短的激發(fā)時間，需要在成像質量與樣本健康之間保持平衡；③降低幀速率，尤其在長時間的熒光成像中，這種情況需要提高相機的靈敏度，保證捕獲微弱的熒光信號。

單通道熒光拍攝，經軟件合成多色熒光圖像

（4）多色熒光成像：在生物學領域應用較多，尤其是在對活細胞標記成像時，需同時對多種物質進行標記，并在一個圖像中顯示，而大多數(shù)熒光染料具有寬發(fā)射光譜，在使用多種染料標記時會出現(xiàn)熒光光譜重疊現(xiàn)象。對于多色熒光成像，有兩種應對思路，一是針對每種染料使用對應的單通道窄帶濾光片，最后通過軟件進行合成，這種方式對成像速度及軟件圖像處理提出較高要求；二是使用寬光譜光源同時激發(fā)，選用雙通濾光片或多通濾光片，這種濾光片的的特點是允許兩種或以上波段熒光信號通過，可實現(xiàn)一組濾光片同時觀察兩種或以上熒光染料，這種方式要求相鄰的發(fā)射光譜范圍沒有重疊，所得到的熒光信號之間能較好的被區(qū)分。

雙通濾光片熒光拍攝，鏡下可同時觀察到B\G兩種熒光信號

4.明美熒光顯微成像解決方案

（1）醫(yī)院真菌、婦科等常規(guī)熒光檢測推薦：MF23/MF31+普通顯微鏡相機MSX1/MC50-S/MS60/MD50等

• 數(shù)顯LED熒光模塊，可定制的單色或三色激發(fā)，推拉式切換，即開即用

•  高數(shù)值孔徑熒光物鏡，高清晰度與高熒光透過率

• 可拍攝數(shù)字圖片，方便出具報告，可合成多色熒光圖像

（2）高校、研究所等科研研究，醫(yī)院癌癥復核等高要求檢測推薦：MF53-N/MF43-N + MG100/MG120 + 高靈敏度相機MC50-S/MS23/MSH12

•  研究級熒光顯微鏡機身，具備更好的熒光效果和更強的擴展性能，應對各種需求

• 6孔轉盤式熒光附件，可按需自主選擇激發(fā)塊，實現(xiàn)對多種熒光染料觀測

• 可定制雙通等特殊濾光片組，實現(xiàn)更高效的FISH等觀察應用需求

• LED激發(fā)光源，大功率寬光譜激發(fā)效果好，即開即用使用便捷，壽命長性價比高

• 高靈敏度相機，更高效實時反饋動態(tài)圖像，搭配軟件可實現(xiàn)FISH等應用

（3）斑馬魚、果蠅、朱墨時序等宏觀熒光觀察推薦：MZX81/MZX100 + 普通顯微鏡相機MSX1/MC50-S/MS60/MD50等

• 高質量平場(復)消色差物鏡，獨立平行雙光路，大變倍比，成像效果好

• 數(shù)顯熒光模塊，可選BG等雙色激發(fā)，紫外單獨外置，減少對樣品和機內鍍膜損害

• 廣泛應用于斑馬魚、線蟲、果蠅、朱墨時序、新材料等領域，豐富經驗

（4）四大各品牌普通顯微鏡升級熒光觀察推薦：數(shù)顯熒光模塊，或批量定制熒光模塊

• 可適配四大各品牌大部分無限遠光學顯微鏡，高性價比升級熒光觀察

• 數(shù)顯屏幕，直觀顯示當前波段和亮度，方便定量分析

• 內置LED熒光光源，可選單色或BGU等三色激發(fā)，可選電動切換或四色激發(fā)

（5）四大各品牌熒光顯微鏡升級LED熒光光源或定制熒光激發(fā)塊推薦：寬光譜大功率熒光光源MG-120，四通道光源MG-120

• 可匹配四大各品牌主流熒光顯微鏡，覆蓋可見光激發(fā)光譜，激發(fā)效果穩(wěn)定

• 觸屏控制器，直觀易用的操作體驗，可加入人走燈滅等智能功能

• 壽命長，即開即用，1個LED光源頂50個汞燈，無需預熱

• 光強調節(jié)高度線性，MG-120支持軟件觸發(fā)和TTL電平脈沖模式觸發(fā)

明美是一家專注顯微成像產品研發(fā)與銷售的高新技術企業(yè)，是中國儀器儀表行業(yè)協(xié)會光學分會理事單位，醫(yī)療器械顯微鏡生產及經營廠家。
公司一直堅持誠信經營，用心服務，提供顯微成像解決方案。為教育、科研、醫(yī)藥、工業(yè)檢測等廣大客戶提供高效、穩(wěn)定的產品與服務。
始終以客戶需求為中心，以品質為根本，以創(chuàng)新為方向，推動顯微行業(yè)的數(shù)字化、電動化、智能化，為顯微領域的國產化進程貢獻力量。